protocolo para aislamiento de esporas de micorrizas

METODOLOGIA


Para la evaluación de hongos micorrícicos arbusculares (MA) se han desarrollado diversas metodologías que incluyen el aislamiento de esporas a partir de suelo, la tinción diferencial de raíces para evidenciar la colonización.

MATERIALES

· Centrifuga
· Tamiz metálico
· Beaker
· Tubos plásticos falcón de 45 ml.
· Laminas porta objetos
· Laminillas cubre objetos
· Pincel o pinzas para recolección de esporas

REACTIVOS

AISLAMIENTO DE ESPORAS

· Peroxido de hidrogeno
· Solución de tween 80 al 2% mas sacarosa (se toman 15 cc )
· Polivinil lactoglicerol

MONTAJE DE ESPORAS

· Reactivo de Melzer
· Alcohol polivinilo- lactofenol (PVL)
· Alcohol polivinilo- acido láctico- glicerol (PVLG)


PRIMERA PRÁCTICA

EXTRACCION, OBSERVACION E IDENTIFICACION DE ESPORAS DE HONGOS DEL SUELO


Se realizo un muestreo representativo de las condiciones en campo en forma de “X “ o “W, con una profundidad entre los 0 y 20 cm. Las muestras fueron tomadas en diferentes puntos con la ayuda de un palin, el suelo colectado se deposito en un balde plástico.


Posteriormente en el laboratorio, se mezcló y se homogenizó el suelo y se tomo una muestra de 10 gramos, a la cual se le adicionaron 100 ml de agua en un beaker de 250 ml, agitándose manualmente con la ayuda de una espátula por un a tiempo aproximado de 15 minutos.

pesaje de muestra

A continuación se procedió a tamizar la mezcla de suelo y agua vertiéndola en el tamiz en el siguiente orden 40, 80 y 100 micras, y se continúo lavando con agua corriente. Se tomaron las muestras de los tamices de 80 y 100 micras.

Seguidamente la muestra tamizada se coloco en un tubo de ensayo y se le adiciono 5 ml de solución de sacarosa al 72 % con tween 80 al 2% de manera que la solución quedo por debajo del material suspendido en agua.

Después se toma el tubo y se observa la interfase de agua – sacarosa con el uso de una jeringa se recoge esta interfase donde se encontraran la espora de la micorriza las cuales se recupera con el uso de un embudo y un papel filtro el cual será ubicado en una caja petri y observado en un estereoscopio

Posteriormente se colocaron los tubos en la centrifuga a 2000 rmp y se sacaron con cuidado los tubos de la centrífuga, evitando romper la interfase de agua – sacarosa. Consecutivamente, con la ayuda de una jeringa, se recogió toda la superficie de la interfase

El contenido de la jeringa se paso al tamiz más pequeño y lavo para eliminar la sacarosa. A continuación el contenido del tamiz se coloco sobre papel filtro con la ayuda de un embudo y se ubicó en una caja de petri para observarlo al estereoscopio



Las esporas aisladas de la caja de petri se pusieron en una lámina a la que se le adiciono una gota de PVL colocándole un cubreobjetos para ser observada al microscopio en donde se tendrán en cuenta características referentes a morfología y color.